Ein häufiges HLA-Allel ist mit asymptomatischem SARS verbunden

Nature Band 620, Seiten 128–136 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Studien haben gezeigt, dass mindestens 20 % der mit SARS-CoV-2 infizierten Personen asymptomatisch bleiben1,2,3,4. Obwohl sich die meisten weltweiten Bemühungen auf schwere Erkrankungen bei COVID-19 konzentrierten, bietet die Untersuchung asymptomatischer Infektionen eine einzigartige Gelegenheit, frühe immunologische Merkmale zu berücksichtigen, die eine schnelle Virusclearance fördern. Unter der Annahme, dass Variationen in den Loci des menschlichen Leukozytenantigens (HLA) den Prozessen zugrunde liegen könnten, die eine asymptomatische Infektion vermitteln, haben wir 29.947 Personen, für die hochauflösende HLA-Genotypisierungsdaten verfügbar waren, in eine Smartphone-basierte Studie zur Verfolgung von COVID-19-Symptomen aufgenommen und Ergebnisse. Unsere Entdeckungskohorte (n = 1.428) umfasste ungeimpfte Personen, die ein positives Testergebnis für SARS-CoV-2 meldeten. Wir testeten den Zusammenhang von fünf HLA-Loci mit dem Krankheitsverlauf und identifizierten einen starken Zusammenhang zwischen HLA-B*15:01 und einer asymptomatischen Infektion, der in zwei unabhängigen Kohorten beobachtet wurde. Wir legen nahe, dass dieser genetische Zusammenhang auf eine bereits bestehende T-Zell-Immunität zurückzuführen ist, und zeigen, dass T-Zellen aus präpandemischen Proben von Personen, die HLA-B*15:01 trugen, auf das immundominante, von SARS-CoV-2 S abgeleitete Peptid NQKLIANQF reagierten . Die Mehrzahl der reaktiven T-Zellen zeigte einen Gedächtnisphänotyp, war hochgradig polyfunktionell und kreuzreaktiv mit einem Peptid, das von saisonalen Coronaviren stammt. Die Kristallstruktur der HLA-B*15:01-Peptidkomplexe zeigt, dass die Peptide NQKLIANQF und NQKLIANAF (von OC43-CoV und HKU1-CoV) eine ähnliche Fähigkeit zur Stabilisierung und Präsentation durch HLA-B*15:01 aufweisen. Schließlich zeigen wir, dass die strukturelle Ähnlichkeit der Peptide die T-Zell-Kreuzreaktivität hochaffiner öffentlicher T-Zellrezeptoren untermauert und die molekulare Grundlage für die HLA-B*15:01-vermittelte, bereits bestehende Immunität bildet.

Trotz einiger widersprüchlicher Angaben zu Symptomen1 haben Studien gezeigt, dass mindestens 20 % der Personen, die mit dem schweren akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infiziert sind, asymptomatisch bleiben2,3,4. Die Untersuchung einer asymptomatischen Infektion bietet eine einzigartige Gelegenheit, frühe Krankheits- und immunologische Merkmale zu berücksichtigen, die eine schnelle Virusclearance fördern. Ein besonderer Fokus auf asymptomatische Infektionen kann unser Verständnis der Krankheitspathogenese verbessern und die laufenden Bemühungen zur Impfstoffentwicklung und zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele unterstützen.

Es bleibt unklar, warum viele Menschen die Infektion ohne größere Komplikationen erfolgreich überstehen, während andere eine schwere Erkrankung entwickeln, selbst ohne bekannte Risikofaktoren für schwere COVID-19-Verläufe5. Es ist jedoch bekannt, dass die Genetik des Wirts an unterschiedlichen immunologischen Reaktionen auf Infektionen und das Fortschreiten der Krankheit beteiligt ist. Seit fast Beginn der globalen Pandemie wurden zahlreiche Studien durchgeführt, die darauf abzielen, die genetischen Grundlagen der unterschiedlichen Ergebnisse bei COVID-19 zu verstehen, darunter die multizentrische Host Genetics Initiative6. Die überwiegende Mehrheit dieser Studien untersuchte jedoch genetische Zusammenhänge mit schwerem Krankheitsverlauf in überwiegend hospitalisierten Kohorten7,8. Obwohl die meisten mit SARS-CoV-2 infizierten Personen einen milden Krankheitsverlauf haben oder völlig asymptomatisch sind, haben daher nur sehr wenige Studien die Genetik im Kontext nicht hospitalisierter, prospektiver, gemeindebasierter Kohorten untersucht.

Die Region des menschlichen Leukozytenantigens (HLA) (6p21) ist die polymorphste und medizinisch wichtigste menschliche Genomregion. HLA-Variationen werden mit Hunderten von Krankheiten und Beschwerden, einschließlich Infektionen, in Verbindung gebracht. Unter den vielen Genen, die an menschlichen Immunantworten beteiligt sind, weisen HLA-Varianten einen der stärksten Assoziationen mit Virusinfektionen auf. HLA wird beispielsweise mit einem schnellen Fortschreiten und der Kontrolle der Viruslast des Humanen Immundefizienzvirus (HIV)9, Hepatitis B, Hepatitis C und anderen Infektionskrankheiten10 in Verbindung gebracht. Bemerkenswerterweise wurden HLA-Allele der Klassen I und II auch mit dem schweren akuten respiratorischen Syndrom in Verbindung gebracht, das durch SARS-CoV11,12,13 verursacht wird.

In-silico-Analysen haben gezeigt, dass HLA relevante Moleküle für das SARS-CoV-2-Risiko und wesentliche Ziele für die Impfstoffentwicklung sind14,15,16,17. HLA-B*46:01 hat beispielsweise eine geringe vorhergesagte Bindung an Peptide von SARS-CoV-2, was darauf hindeutet, dass Personen, die dieses Molekül exprimieren, möglicherweise anfälliger für COVID-1916 sind, was frühere Ergebnisse bestätigt, die eine HLA-B*46:01-Assoziation zeigen mit SARS-Risiko12. Im Gegensatz dazu wurde vorhergesagt, dass HLA-B*15:03 vor COVID-19 schützt, indem es T-Zellen hochkonservierte SARS-CoV-2-Peptide präsentiert16. Kürzlich wurde gezeigt, dass viele SARS-CoV-2-Epitope für CD8+-T-Zellen HLA-spezifisch sind, obwohl es einige Überschneidungen gibt16. Bisher haben relativ wenige Studien HLA-Assoziationen mit Infektionen direkt untersucht, mit gemischten und nicht schlüssigen Ergebnissen in relativ kleinen Kohorten18,19,20. Größere Studien, die sich auf genomweite Daten stützten, um HLA zu unterstellen, fanden keine eindeutigen Zusammenhänge mit Krankheiten7,21; Diese Studien konzentrierten sich jedoch hauptsächlich auf hospitalisierte Patienten mit einem schweren Krankheitsverlauf.

Das Verständnis der Auswirkungen der HLA-Variation auf Krankheiten verspricht aussagekräftige Erkenntnisse zu liefern, die für das Verständnis der Immunpathogenese von COVID-19 relevant sind, und gleichzeitig als Grundlage für die Entwicklung von Impfstoffen und potenziellen Immuntherapien zu dienen. Hier präsentieren wir eine große Studie, die die HLA-Variation im Zusammenhang mit überwiegend leichten Erkrankungen direkt untersucht. Wir luden freiwillige Knochenmarkspender, von denen bereits hochauflösende HLA-Genotypisierungsdaten verfügbar waren, zur Teilnahme an der COVID-19 Citizen Science-Studie ein – einer Smartphone-basierten Studie zur Verfolgung von COVID-19-Symptomen und -Ergebnissen, einschließlich selbst gemeldeter positiver Ergebnisse Tests auf eine SARS-CoV-2-Infektion, um eine prospektive Kohorte zu entwickeln, die derzeit fast 30.000 Personen umfasst, sowie zwei weitere unabhängige Kohorten. Wir kontextualisieren unsere Ergebnisse weiter, indem wir die T-Zell-Reaktivität, das T-Zell-Rezeptor-Repertoire, die Affinität und strukturelle Implikationen für die beobachteten HLA-Assoziationen untersuchen. Unsere Ergebnisse liefern starke Belege für die Rolle von HLA-Klasse I bei der Virusclearance, die bei Personen mit SARS-CoV-2-Infektion zu einer asymptomatischen Infektion führt, und bieten einen wichtigen Rahmen für weitere Studien, die darauf abzielen, die immunologischen und genetischen Grundlagen für die Genesung von SARS-CoV aufzudecken -2 Infektion.

Unsere letzte Kohorte umfasste 1.428 Personen, die einen positiven Test auf eine aktive SARS-CoV-2-Infektion meldeten und sich selbst als weiß identifizierten. Grundlegende demografische Daten für alle Personen sind in der erweiterten Datentabelle 1 aufgeführt. Die vollständige Liste der gemeldeten Krankheiten und Zustände und deren Häufigkeit in dieser Kohorte ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Um festzustellen, ob die HLA-Variation die Wahrscheinlichkeit beeinflusst, dass eine Person nach SARS asymptomatisch bleibt, Bei einer CoV-2-Infektion analysierten wir hochauflösende Genotypisierungsdaten für fünf hochpolymorphe HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-Gene (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1).

Wir fanden heraus, dass das Allel HLA-B*15:01 bei asymptomatischen Personen im Vergleich zu symptomatischen Personen deutlich überrepräsentiert war (Häufigkeit = 0,1103 gegenüber 0,0495, Odds Ratio (OR) = 2,38, 95 %-Konfidenzintervall (CI) = 1,51–3,65, P = 3 × 10−5, Bonferroni-korrigiertes P (Padj) = 0,002). Kein anderes HLA-Allel an irgendeinem Ort war nach Korrektur für mehrere Vergleiche signifikant assoziiert. Die Allelfrequenzen für alle Loci sind in der Ergänzungstabelle 2 angegeben.

Um die Auswirkungen komorbider Erkrankungen sowie Geschlechts- und Altersunterschiede zu berücksichtigen, haben wir eine Reihe von Regressionsmodellen angepasst, konnten jedoch keine Auswirkungen der vom Patienten gemeldeten Komorbiditäten auf die Wahrscheinlichkeit einer asymptomatischen Erkrankung feststellen. Daher wurde unser endgültiges Modell nur für Alter und Geschlecht angepasst und zeigte nach Anpassung für diese Variablen erneut einen signifikanten Zusammenhang von HLA-B*15:01 mit einer asymptomatischen Infektion (OR = 2,40, 95 %-KI = 1,54–3,64, P = 5,67). × 10−5, Padj = 0,003; Tabelle 1).

Schließlich beobachteten wir einen starken additiven Effekt für den zugehörigen Genotyp. Bei Personen, die zwei Kopien von HLA-B*15:01 tragen, ist die Wahrscheinlichkeit, asymptomatisch zu bleiben, mehr als achtmal höher als bei Personen, die andere Genotypen tragen (OR = 8,58, 95 %-KI = 1,74–34,43, P = 0,001). Insgesamt trug jede fünfte Person (20 %), die nach der Infektion asymptomatisch blieb, HLA-B*15:01, verglichen mit 9 % der Patienten, die über Symptome berichteten.

Um zu verstehen, ob zusätzliche HLA-Allele bei einer asymptomatischen Infektion mit HLA-B*15:01 interagieren könnten, haben wir alle paarweisen Zwei-Locus-Haplotypen getestet, die HLA-B enthalten. Insgesamt erwiesen sich die haplotypischen Assoziationen für HLA-B~HLA-DRB1 und HLA-A~HLA-B mit P = 0,01 als signifikant. Bei der Untersuchung spezifischer Allel-Haplotypen wurden diese Assoziationen durch zwei HLA-B*15:01-Haplotypen gesteuert: HLA-B*15:01~HLA-DRB1*04:01 und HLA-A*02:01~HLA-B*15: 01 (Ergänzungstabellen 3 und 4).

Nach Anpassung an Geschlecht und Alter blieb nur die Kombination von HLA-B*15:01 und HLA-DRB1*04:01 nach Korrektur für mehrere Vergleiche signifikant (P = 3 × 10−4, Padj = 0,01). Wir fanden für diese Kombination ein OR (OR = 3,17, 95 %-KI = 1,65–5,80), das über dem für HLA-B*15:01 allein liegt, was darauf hindeutet, dass es in dieser Kohorte zwar nicht signifikant mit der asymptomatischen Infektion allein assoziiert ist Das Klasse-II-Allel HLA-DRB1*04:01 verstärkt die Wirkung von HLA-B*15:01.

Um unsere Ergebnisse zu bestätigen, untersuchten wir zwei unabhängige Kohorten von Patienten europäischer Abstammung. Wir haben zunächst eine erneute Analyse der primären HLA-Genotypdaten in einer britischen Kohorte durchgeführt, über die bereits berichtet wurde22; HLA-B*15:01 wurde aufgrund seiner untergeordneten Bedeutung in den Analysen nicht im Hinblick auf eine asymptomatische Infektion untersucht. Als wir nur das interessierende Allel testeten, stellten wir fest, dass HLA-B*15:01 in dieser Kohorte unter Berücksichtigung von Geschlecht und Alter stark mit einer asymptomatischen Infektion assoziiert ist (P = 0,02, OR = 3,56, 95 %-KI = 1,15–10,94). Ähnlich wie in unserer Entdeckungskohorte stellten wir fest, dass die Trägerhäufigkeit für HLA-B*15:01 bei asymptomatischen Personen 17 % betrug, verglichen mit 7 % bei symptomatischen Patienten (Tabelle 1).

Als nächstes untersuchten wir den Zusammenhang zwischen HLA-B*15:01 und einer asymptomatischen Infektion in der kombinierten UCSF-Kohorte „Prospektive longitudinale COVID-19 Host Immune Response Pathogenesis“ (CHIRP) und „Long-term Impact of Infection with Novel Coronavirus“ (LIINC). Dabei wurde bei 12 von 82 Personen europäischer Abstammung ein asymptomatischer Krankheitsverlauf festgestellt. Wir fanden erneut heraus, dass die Trägerhäufigkeit von HLA-B*15:01 bei asymptomatischen Personen im Vergleich zu symptomatischen Patienten (8,6 %) außergewöhnlich hoch war (25 %). Obwohl die Aussagekraft durch die Stichprobengröße etwas begrenzt war und daher nicht als völlig unabhängige Replikation angesehen werden kann, weisen die Ergebnisse einen starken Trend auf, der unsere Feststellung einer starken Assoziation dieses Allels mit asymptomatischer Erkrankung unterstützt (P = 0,13, OR = 3,44, 95 %-KI = 0,50–23,64; Tabelle 1). Schließlich bestätigte eine Metaanalyse aller drei Datensätze (Citizen Science, UK, CHIRP/LIINC) den starken und konsistenten Zusammenhang von HLA-B*15:01 mit asymptomatischer Infektion (P < 10–4, OR = 2,55, 95 %). CI = 1,73–3,77; ergänzende Abbildung 1).

Aufgrund ihrer hohen Avidität für ihre zugehörigen T-Zellrezeptoren wurden pHLA-Tetramer (Peptid-HLA) systematisch zur Visualisierung und Quantifizierung niederfrequenter antigenspezifischer T-Zellen ex vivo mithilfe der Durchflusszytometrie eingesetzt23. Wir konzentrierten uns auf vier SARS-CoV-2-Epitope (CVADYSVLY, HVGEIPVAY, NQKLIANQF und RVAGDSGFAAY), von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie bei Patienten mit COVID-19, die HLA-B*15:01 tragen, eine durch zytotoxische CD8+ T-Zellen vermittelte zelluläre Immunität hervorrufen (Ref. 24,25,26,27,28). Als nächstes führten wir eine Ex-vivo-pHLA-Tetramer-Bewertung mit den SARS-CoV-2-Peptiden durch, um Antigen-spezifische CD8+-T-Zellen in neun präpandemischen Proben peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) nachzuweisen. Wir beobachteten Tetramer+CD8+-T-Zellen für drei der SARS-CoV-2-Epitope (Abb. 1a, b, Ergänzungstabellen 5 und 6 und Ergänzungsabbildungen 2 und 3).

a–c: Eine kombinatorische Ex-vivo-Tetrameranalyse für die vier angegebenen Peptide wurde in neun Spenderproben vor der Pandemie durchgeführt. a,b, Dargestellt sind die Anzahl der Spender mit nachweisbaren Tetramer+CD8+-T-Zellen (a) und deren Häufigkeiten (b). c, Der Anteil naiver (CD45RA+CCR7+) und Gedächtniszellen (Kombination aus CD45RA−CCR7−, CD45RA−CCR7+, CD45RA+CCR7−) unter Tetramer+CD8+ T-Zellen (basierend auf n = 9 Proben). d, Phänotypische Analyse nach TAME von Ex-vivo-Tetramer+ NQK-Q8-spezifischen (tet-Q8) und NQK-A8-spezifischen (tet-A8) T-Zellen bei 7 bzw. 6 Spendern. Zelltypen wurden wie folgt definiert: Tnaiv (CD45RA+CCR7+CD95−); TSCM (Stammzellgedächtnis, CD45RA+CCR7+CD95+); TCM (zentraler Speicher, CD45RA−CCR7+); TEM (Effektorspeicher, CD45RA−CCR7−); TEMRA (terminal differenziert, CD45RA+CCR7−). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM

NQKLIANQF (im Folgenden NQK-Q8) war im höchsten Anteil der Proben nachweisbar (5 von 9; 55,6 %). Bemerkenswert ist, dass bei diesen Spendern 100 % der Ex-vivo-NQK-Q8-Tetramer+CD8+-T-Zellen Gedächtnis-T-Zellen waren, was auf eine bereits bestehende T-Zell-Immunität gegen SARS-CoV-2 bei einer Untergruppe von Personen hinweist, die HLA-B*15:01 tragen die zuvor keinen Kontakt mit dem Virus hatten (Abb. 1c und Ergänzungstabelle 5).

NQK-Q8 wurde zuvor als immundominant identifiziert28, und diese Autoren zeigten auch, dass NQK-Q8-spezifische T-Zellen von HLA-B*15:01+-Patienten mit einer Infektion kreuzreaktiv mit dem hochhomologen Peptid NQKLIANAF (im Folgenden NQK-A8) waren ) von den saisonalen Coronaviren HKU1-CoV und OC43-CoV. Angesichts des hohen Anteils an NQK-Q8-spezifischen Gedächtnis-T-Zellen im Vergleich zu naiven CD8+-T-Zellen, die in den ersten von uns getesteten Proben vor der Pandemie beobachtet wurden (Abb. 1c), wollten wir feststellen, ob derselbe Phänotyp auch für beobachtet wurde das Peptid NQK-A8 in zusätzlichen Proben von HLA-B*15:01+ Personen ohne Exposition gegenüber SARS-CoV-2. Wir führten eine Ex-vivo-Tetramer-Magnetanreicherung (TAME) mit Tetrameren jedes Peptids, NQK-Q8 und NQK-A8, durch, die an HLA-B*15:01 (tet-Q8 bzw. tet-A8) gebunden waren (Abb. 1d, erweitert). Daten Abb. 1 und 2 und ergänzende Abb. 4) unter Verwendung einer größeren Anzahl zusätzlicher Proben (n = 7 und n = 5 für tet-Q8 bzw. tet-A8). Gemäß unserer vorherigen Studie25 haben wir Proben aus der Zeit vor der Pandemie aus den USA und Australien verwendet. Alle diese Proben wiesen Tetramer+CD8+-T-Zellen auf. Insgesamt beobachteten wir NQK-Q8-spezifische T-Zellen bei 75 % der HLA-B*15:01+-Spender ohne vorherige Exposition gegenüber SARS-CoV-2 (n = 12 von 16; Abb. 1a–d und erweiterte Daten). Abb. 1).

Als nächstes analysierten wir den Phänotyp der Tetramer+CD8+-T-Zellen für beide NQK-Peptide (Abb. 1d). Wir beobachteten eine Fülle von Gedächtnis-T-Zellen, die für NQK-Q8 spezifisch sind, in Proben vor der Pandemie (Abb. 1d und erweiterte Daten, Abb. 2). Ein ähnliches phänotypisches Profil wurde für die NQK-A8-spezifischen T-Zellen beobachtet, wobei die meisten Tetramer+CD8+-T-Zellen Gedächtniszellen waren (Abb. 1d und Extended Data Abb. 2). Der hohe Anteil an Effektor-Gedächtnis- und Effektor-Gedächtnis-reexprimierenden CD45RA (TEMRA) T-Zellen (29 % für NQK-Q8 und 31 % für NQK-A8) weist auf eine starke T-Zell-Reaktion auf diese Peptide hin, was eine wünschenswerte Eigenschaft für den Schutz darstellt Immunität. Wir konnten Ex-vivo-Tetramer+CD8+-T-Zellen für NQK-Q8 (n = 7) und NQK-A8 (n = 6) nachweisen (Abb. 1d und erweiterte Daten Abb. 1). Insgesamt zeigen unsere Daten das Vorhandensein von CD8+-T-Zellen, die für beide NQK-Peptide spezifisch sind, mit einem ähnlichen Phänotyp und einer ähnlichen Größe bei nicht exponierten Spendern.

Als nächstes versuchten wir herauszufinden, ob die T-Zell-Kreuzreaktivität, die zuvor28 bei Patienten mit Infektion beobachtet wurde, auch bei nicht exponierten Personen beobachtet werden kann. Wir haben T-Zelllinien mit jedem Peptid separat unter Verwendung von PBMCs von nicht exponierten und ungeimpften Spendern aufgebaut (n = 5, in vitro). Jede Zelllinie wurde dann mit einem der beiden Peptide restimuliert. Die Erkennung und Aktivierung von CD8 + T-Zellen wurde durch Tetramerfärbung bzw. intrazelluläre Zytokinfärbung bestimmt (Abb. 2a und ergänzende Abb. 4).

a, Gesamtzytokinproduktion durch CD8+ T-Zellen in NQK-A8- und NQK-Q8-spezifischen T-Zelllinien. Jede peptidspezifische T-Zelllinie wurde wie angegeben einzeln mit ihrem zugehörigen Peptid oder dem homologen Peptid restimuliert und die Zytokinantwort wurde durch intrazelluläre Zytokinfärbung gemessen (n = 5 Spender). Es werden Prozentsätze der Effektorfunktionen (IFNγ, TNF, IL-2, MIP-1β, CD107a) abzüglich der Kontrolle ohne Peptid angegeben. b, In-vitro-Tetrameranalyse für die NQK-Q8- und NQK-A8-spezifischen T-Zelllinien (n = 5 Spender). Die Zelllinien wurden mit einem einzelnen tet-A8-Tetramer (orangefarbener Balken) oder tet-Q8-Tetramer (violetter Balken) oder beiden Tetrameren (grüner Balken) tetramergefärbt. Dargestellt ist die Häufigkeit von Tetramer+CD8+ T-Zellen. Bei den Daten handelt es sich um Medianwerte ± Interquartilbereich. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mithilfe zweiseitiger ungepaarter t-Tests verglichen. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. NS, nicht signifikant. c, Polyfunktionalitätsanalyse von CD8+ NQK-Peptid-spezifischen T-Zellen von fünf nicht exponierten Spendern. Die Anzahl der Funktionen wird auf einer Skala von 5 (schwarz) bis 1 (weiß) angezeigt. Bei den Daten handelt es sich um die relative Häufigkeit (%) der gesamten Zytokin+CD8+-T-Zellen. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mithilfe zweiseitiger ungepaarter t-Tests ermittelt. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen und das Ergebnis war nicht signifikant.

Alle Zelllinien waren durch das Vorhandensein von Tetramer+CD8+-T-Zellen für beide Peptide gekennzeichnet (ergänzende Abbildung 5) und zeigten eine bidirektionale Kreuzreaktivität, wodurch T-Zellen beide von den verschiedenen Viren abgeleiteten NQK-Peptide erkennen können. Die Größe der Tetramer+CD8+-T-Zellen war bei den Spendern unterschiedlich und bei den mit dem NQK-A8-Peptid erzeugten Zelllinien etwas höher (Abb. 2b). Die gleichzeitige Färbung der T-Zelllinien mit beiden Tetrameren (tet-Q8, Allophycocyanin (APC) konjugiert; tet-A8, Phycoerythrin (PE) konjugiert) zeigte, dass die überwiegende Mehrheit der T-Zellen kreuzreaktiv war (ergänzende Abbildung 5). ).

Anschließend haben wir den Grad der T-Zell-Reaktion auf jedes Peptid gemessen. T-Zellen aller Spender außer GR8 reagierten auf das verwandte Peptid (Abb. 2a). Bei vier von fünf Spendern wurde unabhängig vom Peptid eine stärkere Reaktion in den NQK-A8-spezifischen Zelllinien beobachtet (Abb. 2a). Diese Ergebnisse ähnelten denen, die wir zuvor für die von SARS-CoV-2 und HKU1-CoV/OC43-CoV abgeleiteten N(105–113)-Peptide im Zusammenhang mit HLA-B*07:02 beobachtet hatten, wobei die T-Zellen wurden nach der Präsentation des vom saisonalen Coronavirus abgeleiteten Peptids stärker stimuliert als das von SARS-CoV-2 abgeleitete Peptid bei nicht exponierten Spendern25.

Obwohl der Prozentsatz an Zytokin+CD8+-T-Zellen zwischen den Spendern unterschiedlich war (etwa 0–8 %; Abb. 2a), waren die Menge und das Profil der Zytokine für jede Zelllinie zwischen den beiden Peptiden vergleichbar. Diese Beobachtung legt nahe, dass beide NQK-Peptide T-Zellen in ähnlicher Stärke stimulieren, was auf ein hohes Maß an T-Zell-Kreuzreaktivität zurückzuführen sein könnte. Als nächstes untersuchten wir das Funktionsprofil der CD8+ T-Zellen, das ihrer Fähigkeit entspricht, verschiedene Effektorfunktionen zu zeigen (IFNγ, TNF, IL-2, MIP-1β, CD107a; Abb. 2c). Für beide Zelllinien, die mit einem der beiden Peptide restimuliert wurden, wurde eine hochgradig polyfunktionale T-Zell-Antwort mit bis zu fünf exprimierten Funktionen beobachtet. Mindestens 40 % (n = 2 von 5) und bis zu 80 % (n = 4 von 5) der Spender hatten T-Zellen, die alle fünf Funktionen in einer oder mehreren Zelllinien aufwiesen. Durchschnittlich 2,5–4,7 % der CD8+-T-Zellen zeigten alle fünf getesteten Funktionen (Abb. 2c und erweiterte Daten, Abb. 3).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die T-Zell-Reaktion gegen NQK-Peptide von saisonalen Coronaviren und SARS-CoV-2 bei Personen, die nie SARS-CoV-2 ausgesetzt waren, hochgradig kreuzreaktiv und polyfunktionell ist.

Als nächstes bestimmten wir das T-Zell-Rezeptor-Repertoire (TCR), das sowohl für NQK-A8- als auch für NQK-Q8-Peptide spezifisch ist. Mithilfe der Einzelzellsortierung von Tetramer+CD8+-T-Zellen und der TCR-Sequenzierung erhielten wir 456 produktive klonotypische Sequenzen von acht nicht exponierten Spendern und einem dreifach geimpften Spender (Ergänzungstabelle 7). Die TCR-Repertoires von T-Zellen, die für jedes oder beide NQK-Peptide (Einzel- oder Doppeltetramer + CD8 + T-Zellen) spezifisch sind, wurden sowohl aus T-Zelllinien (in vitro) als auch aus unstimulierten PBMCs (ex vivo) erhalten (Abb. 3a, b, Ergänzungstabelle). 7, Erweiterte Daten Abb. 4 und 5 und Ergänzende Abb. 6).

a,b, Analyse des ex vivo TCR-Repertoires für NQK-A8- und NQK-Q8-spezifische T-Zellen nach TAME auf Basis der Verwendung von TRBV (a) und TRAV (b). Die Kreisdiagramme zeigen den Prozentsatz jedes TRBV oder TRAV, der in den nach Einzelzellen sortierten Klonotypen verwendet wird. Die CDR3β- und CDR3α-Sequenzmotive werden jeweils unterhalb der Kreisdiagramme für die TCRs mit der voreingenommenen Expression von TRBV7-2/7-8 gepaart mit TRAV9/26 oder TRAV21 angezeigt, einschließlich der öffentlichen TCRs. c,d, Die Bindungsreaktion (Antworteinheiten (RU)) von D5A- (c) und D9A-TCRs (d) (Analyt) gegen HLA-B*15:01-NQK-Komplexe (A8 in Orange und Q8 in Lila). Der öffentliche TCR D5A exprimiert TRBV7-2 gepaart mit TRAV21, und der öffentliche D9A-TCR exprimiert TRBV7-2 gepaart mit TRAV9-2; Die CDR3β- und CDR3α-Sequenzen für jeden öffentlichen TCR werden unter den Bindungskurven angezeigt. Die SPR-Steady-State-Bindungskurven stellen die Bindung unter einem TCR-Konzentrationsbereich von 0,39–100 μM dar. n = 2 biologisch unabhängige Experimente, die doppelt durchgeführt wurden; Die Grafik zeigt die Ergebnisse eines doppelt durchgeführten Experiments, dargestellt durch die schwarzen Punkte.

Die NQK-spezifischen TCR-Repertoires überschneiden sich weitgehend mit gemeinsamen Klonotypen und öffentlichen TCRs (Ergänzungstabellen 7 und 8). Das Ex-vivo-TCR-Repertoire war stark verzerrt mit Klonotypen, die TRAV9 (31 %) oder TRAV21 (15 %) exprimierten, gepaart mit dem dominanten TRBV7-2/7-8 (71 %) (Abb. 3a, b und Ergänzungstabelle 7). Obwohl die TRBV7-2/7-8-Klonotypen auch im In-vitro-Repertoire vorhanden waren, war ihre Häufigkeit verringert (11 %); Wir beobachteten auch eine Expansion der Klonotypen TRBV5-4/5-8+ (35 %), TRBV9+ (18 %) und TRBV20-1+ (24 %). In ähnlicher Weise wurde eine Häufigkeitsverschiebung für die TRAV-Gennutzung im In-vitro-TCR-Repertoire mit einem Rückgang der TRAV21+-Klontypen (6 %), einem Fehlen von TRAV9+-Klontypen und dem Auftreten von TRAV19+ (21 %), TRAV38-2/DV8* beobachtet. 01+ (19 %) und TRAV41+ (47 %) Klonotypen. Die Klonotypen TRAV38-2/DV8*01+ und TRAV41+ wurden jeweils nur bei einem Spender expandiert (GR81 bzw. GR80), und diese paarten sich nur mit TRBV20-1 bzw. TRBV5-4/5-8; Diese erweiterten Klonotypen waren kreuzreaktiv (Ergänzungstabelle 7). Die CD8+ T-Zellen, die sowohl tet-A8 als auch tet-Q8 binden konnten, exprimierten hauptsächlich TRBV7-2/7-8 (42 %) gepaart mit TRAV21 (54 %); TRBV9 (36 %, Paarung unbekannt); oder TRBV5-4/5-8 (12 %) gepaart mit TRAV41 (36 %) (Ergänzungstabelle 7). Darüber hinaus wiesen die CDR3-Schleifenlänge und die Sequenzmotive Ähnlichkeiten auf (Abb. 3 und Extended Data Abb. 5). Auch öffentliche TCRs, definiert als identische TCRs, die von Einzelpersonen geteilt werden, wurden isoliert29. Die öffentlichen NQK-spezifischen TCRs waren TRBV7-2/7-8+ gepaart mit TRAV21 oder TRAV9-2 und wurden sowohl ex vivo als auch in vitro bei nicht exponierten Spendern beobachtet (Abb. 3c, d und Ergänzungstabelle 8). Diese öffentlichen und kreuzreaktiven TCRs wurden auch von Spendern isoliert, die sich von COVID-19 erholt hatten, und/oder von zuvor geimpften Spendern28 (Ergänzungstabelle 8). Dieser Befund zeigt das Potenzial für einen starken bereits vorhandenen Immungedächtnispool kreuzreaktiver öffentlicher TCRs, die für die NKQ-Peptide spezifisch sind und dem nach einer Infektion beobachteten ähnelt. Die phänotypischen Profile der Klonotypen, die die öffentlichen TCRs ex vivo in nicht exponierten Spendern exprimierten, waren entweder Stammgedächtnis- oder zentrale Gedächtnis-T-Zellen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die NQK-Q8- und NQK-A8-spezifischen TCR-Repertoires durch das Vorhandensein öffentlicher und kreuzreaktiver TCRs bei nicht exponierten Spendern verzerrt sind, vergleichbar mit Beobachtungen bei Spendern, die sich von COVID-19 erholt haben und/oder geimpften Spendern ( Ergänzende Abbildungen 6 und 7). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Vorhandensein von gedächtniskreuzreaktiven NQK-spezifischen TCRs vor der Infektion eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort auf SARS-CoV-2 spielen und zu einer asymptomatischen Infektion bei Personen beitragen könnte, die HLA-B*15:01 tragen.

Das auf HLA-B*15:01 beschränkte Peptid NQK-Q8 ist bei allen SARS-CoV-2-Varianten konserviert, auch bei der neuen XBB-Variante von Omicron, und unterscheidet sich nur durch eine Aminosäure vom HKU1-CoV/OC43-CoV-Peptid (Ergänzende Abbildung 8). Wichtig ist, dass zuvor gezeigt wurde, dass NQK-Q8-reaktive T-Zellen von mit SARS-CoV-2 infizierten HLA-B*15:01+-Individuen kreuzreaktiv mit dem homologen Peptid saisonaler Coronaviren sind28. Da wir das Vorhandensein einer bereits bestehenden T-Zell-Immunität in präpandemischen Proben und eine Kreuzreaktivität der NQK-Peptid-spezifischen T-Zellen gezeigt haben (Abb. 1 und 2), wollten wir untersuchen, ob sich die Aminosäure im NQK verändert Peptide von SARS-CoV-2 und den saisonalen Coronaviren HKU1-CoV und OC43-CoV beeinflussen die Stabilität von HLA-B*15:01.

Wir haben das HLA-B*15:01-Molekül in Gegenwart jedes Peptids neu gefaltet und einen thermischen Schmelzassay mittels Differential Scanning Fluorimetry (DSF) durchgeführt. Beide pHLA-Komplexe zeigten den gleichen thermischen Schmelzpunkt (Tm; Abb. 4a und Ergänzungstabelle 9), was darauf hinweist, dass die Änderung der Gln> Ala-Aminosäure die Gesamtstabilität des pHLA nicht beeinflusst. Wir haben jedes Peptid in einem Komplex mit HLA-B*15:01 kristallisiert und ihre Strukturen mit hoher Auflösung gelöst (Abb. 4b, Extended Data Table 2 und Extended Data Abb. 6). Insgesamt nahm NQK-Q8 eine kanonische Konformation innerhalb der Antigenbindungsspalte des HLA-B*15:01-Moleküls an30. Das Gln an Position 2 (P2) wurde tief in die B-Tasche von HLA-B*15:01 eingefügt, wohingegen der primäre Ankerrest P9-Phe an die F-Tasche band. Der zentrale Teil war mobiler als der Rest des Peptids (Extended Data Abb. 6). Das NQK-Q8-Peptid ist fünf seiner neun Reste (P1-Asn, P4-Leu, P6-Ala, P5-Asn und P8-Gln) dem Lösungsmittel und möglicherweise zirkulierenden T-Zellen ausgesetzt. Das NQK-A8-Peptid band in ähnlicher Weise in der HLA-B*15:01-Spalte (Abb. 4b und erweiterte Daten Abb. 6). Die Überlagerung der beiden pHLA-Strukturen ergab einen sehr geringen Unterschied zwischen den beiden Komplexen, mit einer quadratischen Abweichung von 0,08 Å für die Cα-Atome der Antigenbindungsspalte (Reste 1–180) und 0,12 Å für die Peptide. Es wurde nur eine gewisse lokale Umordnung um das P8 des Peptids mit einer Verschiebung der Glu76-Seitenkette beobachtet, um sterische Konflikte mit dem P8-Gln zu vermeiden (Abb. 4b). Diese Veränderung, die sich auf der Oberfläche des Peptids befindet, könnte die T-Zell-Interaktion beeinflussen und die TCR-Affinität verändern. Um die Auswirkung des P8-Unterschieds innerhalb der NQK-Peptide zu testen, haben wir einige repräsentative TCRs ausgewählt, um Affinitätsmessungen mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) durchzuführen. Wir haben die drei öffentlichen TRBV7-2+-TCRs ausgewählt, gepaart mit entweder TRAV9-2 (D9A-TCR) oder TRAV21 (A6A- und D5A-TCRs) (Abb. 3c, d und Ergänzungstabelle 8).

a, DSF-Diagramme, die die normalisierte Fluoreszenzintensität gegenüber der Temperatur für HLA-B*15:01 in einem Komplex mit dem NQK-Q8- (lila) oder NQK-A8- (orange) Peptid zeigen, gemessen bei Konzentrationen von 5 μM und 10 μM. n = 2 biologisch unabhängige Experimente, die in zweifacher Ausfertigung durchgeführt wurden, dargestellt durch die verschiedenen Linien. b, Überlagerung der Kristallstrukturen von HLA-B*15:01 (weißer Cartoon) in einem Komplex mit entweder dem NQK-Q8-Peptid (lila Stab) oder dem NQK-A8-Peptid (orangefarbener Stab).

Alle getesteten TCRs konnten mit hoher Affinität (Kd-Bereich 6–20 μM) sowohl an die NQK-A8- als auch an die NQK-Q8-Peptide binden, die vom HLA-B*15:01-Molekül präsentiert werden (Abb. 3c, d, Erweiterte Daten Abb. 7 und 8 und Ergänzungstabelle 10). Wir beobachteten eine langsamere Dissoziationsrate für die beiden TRAV21+-TCRs (A6A- und D5A-TCRs) im Vergleich zum TRAV9+-D9A-TCR (Extended Data Abb. 7). Die TCRs unterscheiden sich auch in ihren CDR3β-Schleifen.

In einer früheren Studie28 wurde die Kreuzreaktivität zweier NQK-Q8-spezifischer TCRs (TCR1 und TCR2), die in Jurkat-Zellen transfiziert wurden, gezeigt. Die veröffentlichten TCR1 und TCR228 unterscheiden sich in jeder CDR3-Schleife nur um einen Rest von den A6A- bzw. D5A-TCRs (Ergänzungstabelle 8). Dies spiegelt sich in der hier beobachteten ähnlichen Affinität der A6A- und D5A-TCRs für die NQK-A8- und NQK-Q8-Peptide wider (Ergänzungstabelle 10). Insgesamt zeigen unsere Daten, dass die ähnliche Konformation und Fähigkeit zur Stabilisierung des HLA-B*15:01-Moleküls der beiden NQK-Peptide die ähnliche Affinität untermauert, die für die öffentlichen TCRs beobachtet wurde. Darüber hinaus könnte die hohe Affinität dieser TCRs zu den NQK-Peptiden eine schnelle Expansion dieser Gedächtniszellen nach einer SARS-CoV-2-Infektion auslösen.

Das Verständnis der biologischen Grundlagen einer asymptomatischen Infektion mit SARS-CoV-2 hat wichtige Auswirkungen auf Maßnahmen im Bereich der öffentlichen Gesundheit, das Impfstoffdesign und die therapeutische Entwicklung. Hier liefern wir Hinweise auf eine genetische Grundlage und die mechanistische Erklärung, die einer asymptomatischen Erkrankung zugrunde liegt. Mithilfe einer großen Datenbank und mobiler Technologie können wir in dieser Crowdsourcing-Studie wichtige Einblicke in die immunogenetischen Grundlagen einer asymptomatischen SARS-CoV-2-Infektion gewinnen. Durch den Einsatz einer mobilen Anwendung und einer bereits vorhandenen Datenbank für die medizinische Forschung konnten wir fast 30.000 Personen, die zuvor auf HLA genotypisiert wurden, auf Virusinfektion und Krankheitsverlauf untersuchen. Wir ergänzen unsere Ergebnisse einer starken HLA-Assoziation mit einem asymptomatischen Krankheitsverlauf in dieser einzigartigen Kohorte durch funktionelle und strukturelle Studien, um ein Modell der bereits bestehenden Immunität zu unterstützen und die beobachtete HLA-Assoziation zu erklären.

Wir zeigen, dass HLA-B*15:01 bei Teilnehmern, die ein positives Testergebnis für SARS-CoV-2 melden, signifikant mit einer asymptomatischen Infektion assoziiert ist. Wir haben beobachtet, dass Personen, die dieses gemeinsame Allel tragen (ungefähr 10 % bei Personen mit europäischer Abstammung), nach einer SARS-CoV-2-Infektion mehr als doppelt so häufig asymptomatisch bleiben wie diejenigen, die dies nicht tun, und eine bemerkenswerte Wirkung von HLA-B* 15:01 Homozygotie erhöht die Chance, asymptomatisch zu bleiben, um mehr als das Achtfache. Dies deutet auf wichtige Merkmale einer frühen Infektion mit SARS-CoV-2 hin. Als Beleg für die Rolle von HLA-B*15:01 bei der Vermittlung asymptomatischer Infektionen fanden wir in zwei unabhängigen Kohorten eine sehr ähnliche Häufigkeitsverteilung dieses Allels bei asymptomatischen und symptomatischen Patienten.

Trotz einer wachsenden Zahl veröffentlichter Studien ist die Rolle der HLA-Variation bei COVID-19 weiterhin unklar, es gibt bisher keinen klaren Konsens in der Literatur und vor allem gibt es nur wenige Studien, die asymptomatische Infektionen als primären Phänotyp untersuchen18. Unsere erneute Analyse der Primärdaten, die einem berichteten Zusammenhang zwischen HLA-DRB1*04:01 und asymptomatischer Infektion22 zugrunde liegen, ergab eindeutige Beweise für die Rolle von HLA-B*15:01 bei asymptomatischen Erkrankungen, die in der ersten Studie nicht berichtet wurden. Obwohl die Daten in unserer Entdeckungskohorte die Assoziation für HLA-DRB1*04:01 allein nicht bestätigten, stellten wir fest, dass dieses Allel die Wirkung von HLA-B*15:01 verstärkte, wenn das Paar in Kombination vorlag. Beachten Sie, dass dies das HLA-DRB1-Allel ist, das bei Personen in den Vereinigten Staaten, die sich selbst als weiß bezeichnen, am häufigsten mit HLA-B*15:01 assoziiert ist31 und es daher schwierig ist, einen echten Effekt von einem Effekt zu unterscheiden, der mit einem Bindungsungleichgewicht zusammenhängt zwischen diesen Orten, sofern nicht direkt getestet. In ähnlicher Weise wurde in einer anderen aktuellen Veröffentlichung, die einen Zusammenhang von HLA-DRB1-Allelen mit einer asymptomatischen Infektion beschreibt, kein Genotyp für HLA-B32 ermittelt. Schließlich wurden in zwei weiteren großen Studien, in denen Patientenfragebögen zu Symptomen verwendet wurden, die mildesten Symptome, die bei einer SARS-CoV-2-Infektion häufig auftreten (z. B. laufende Nase und Kratzen im Hals), nicht berücksichtigt, was zu einer viel weniger strengen Definition einer asymptomatischen Infektion führte als wir haben hier33,34 berücksichtigt.

Infektionen der Atemwege stellen ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit dar und stellen eine erhebliche Belastung dar, insbesondere für kleine Kinder und ältere Menschen35,36. Vier Stämme saisonaler Coronaviren (229E-CoV, NL63-CoV, OC43-CoV und HKU1-CoV) machen jedes Jahr 15 bis 30 % aller Atemwegsinfektionen aus37. Insbesondere haben frühere Studien gezeigt, dass T-Zellen mit SARS-CoV-2 und saisonalen Coronavirus-Peptiden kreuzreagieren können, was darauf hindeutet, dass eine lang anhaltende T-Zell-Schutzimmunität möglicherweise die Schwere von COVID-1925 begrenzen kann. Darüber hinaus zeigte eine aktuelle Studie28 eine Kreuzreaktivität von T-Zellen mit SARS-CoV-2 und saisonalen Coronaviren für ein HLA-B*15:01-beschränktes immundominantes Epitop (NQK-Q8) bei Personen, die zwei Dosen des Pfizer-BioNTech BNT162b2 erhielten mRNA-Impfstoff. Um die Hypothese zu testen, dass HLA-B*15:01 asymptomatische Erkrankungen durch bereits bestehende T-Zell-Immunität vermitteln kann, analysierten wir immundominante Epitope in T-Zellen von menschlichen PBMCs von gesunden Personen aus der Zeit vor der Pandemie. Wir beobachteten, dass T-Zellen aus einer Untergruppe gesunder Spender, die HLA-B*15:01 trugen und nie SARS-CoV-2 ausgesetzt waren, auf das SARS-CoV-2-Peptid NQK-Q8 reagierten, und die meisten der reaktiven Zellen zeigten eine Reaktion ein Gedächtnisphänotyp. Die Sequenzidentität zwischen SARS-CoV-2- und saisonalen Coronaviren-Peptiden, mit Ausnahme einer einzelnen Aminosäuresubstitution, könnte die Kreuzreaktivität der T-Zellen erklären. Allerdings war ein direkter Nachweis, dass Peptide von SARS-CoV-2 und den saisonalen Coronaviren OC43-CoV und HKU1-CoV in der HLA-B*15:01-Spalte stabil sind, notwendig, um unsere Hypothese weiter zu untermauern.

Durch unsere Untersuchung der Kristallstrukturen des HLA-B*15:01-Moleküls in Gegenwart jedes Peptids haben wir gezeigt, dass sowohl NQK-Q8 (SARS-CoV-2) als auch NQK-A8 (OC43-CoV und HKU1-CoV ) Spike-Peptide verfügen über eine ähnliche Fähigkeit, das HLA-B*15:01-Molekül zu stabilisieren, und werden von HLA-B*15:01 in einer ähnlichen Konformation präsentiert, was die molekulare Grundlage für T-Zell-Kreuzreaktivität und bereits bestehende Immunität darstellt . Diese Beobachtung steht im Einklang mit früheren Untersuchungen an nicht infizierten HLA-B*07:02+-Personen, die aufgrund der Anwesenheit kreuzreaktiver T-Zellen in der Lage sind, das von SARS-CoV-2 abgeleitete N(105–113)-Peptid zu erkennen das homologe N(105–113)-Peptid aus OC43-CoV und HKU1-CoV25. Bemerkenswerterweise wurde diese T-Zell-Kreuzreaktivität mit einer weniger schweren COVID-19-Erkrankung in Verbindung gebracht38.

Unsere Daten zeigen, dass sowohl saisonale als auch pandemische Coronavirus-abgeleitete NQK-Peptide zu einer hochgradig polyfunktionalen T-Zell-Antwort im Zusammenhang mit HLA-B*15:01 führen können, wobei T-Zellen unterschiedliche Effektorfunktionen aufweisen können (IFNγ, TNF, IL- 2, MIP-1β, CD107a). Die Polyfunktionalität von T-Zellen ist von entscheidender Bedeutung, da sie zu einer überlegenen virussuppressiven Aktivität führen kann39,40; Es ist mit hochaffinen TCRs verbunden, die niedrige Antigenkonzentrationen erkennen können39,41, und es ist prädiktiv für die schützende Immunität und die Wirksamkeit des Impfstoffs42,43,44. Das hohe Maß an Polyfunktionalität, das für die CD8+ T-Zellen gegenüber dem NQK-Q8-Peptid bei nicht exponierten Personen beobachtet wurde, steht im Gegensatz zu der moderaten Polyfunktionalität, die für das HLA-B*07:02-beschränkte SARS-CoV-2 N(105–113)-Peptid beobachtet wurde ( SPRWYFYYL), das auch eine hohe Sequenzähnlichkeit mit dem OC43/HKU-1-CoV N(105–113)-Peptid (LPRWYFYYL) aufweist25. Obwohl im HLA-B*07:02-N(105–113)-spezifischen TCR-Repertoire eine gewisse voreingenommene Verwendung von TCR-Genen beobachtet wurde, konnten wir das Vorhandensein öffentlicher TCRs nicht beobachten25. Im Gegensatz dazu beobachteten wir, dass das HLA-B*15:01-NQK-spezifische TCR-Repertoire durch die Existenz öffentlicher TCRs gekennzeichnet war. Der Gedächtnisphänotyp der öffentlichen TCRs bei nicht exponierten Spendern deutet auch stark darauf hin, dass sie HLA-B*15:01+-Spendern, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind, einen Schutzvorteil bieten könnten.

Das Vorhandensein eines hohen Maßes an Gedächtnis-, polyfunktionalen, hochaffinen und öffentlichen kreuzreaktiven T-Zellen bei nicht exponierten Spendern untermauert wahrscheinlich den starken Zusammenhang zwischen dem Allel HLA-B*15:01 und einer asymptomatischen SARS-CoV-2-Infektion. Das Vorhandensein kreuzreaktiver öffentlicher TCRs vor der Infektion, das auch nach einer Infektion oder Impfung beobachtet wird28, könnte bei Personen, die HLA-B*15:01 tragen, eine schnelle und schützende Immunantwort hervorrufen. Diese Eigenschaft könnte HLA-B*15:01 zu einem allgemein schützenderen Allel machen als HLA-B*07:02, was als potenziell begrenzend für die Schwere der COVID-19-Erkrankung beschrieben wurde38. Unsere Ergebnisse zeigen auch die Bedeutung einer bereits bestehenden Immunität25,28,45,46, die zu einem Gedächtnispool kreuzreaktiver T-Zellen führt, die bereit sind, Infektionen zu bekämpfen23,37.

Die Untersuchung von T-Zellen bei Patienten mit asymptomatischer SARS-CoV-2-Infektion hat auf robuste T-Zell-Reaktionen hingewiesen, die denen mit symptomatischer Erkrankung ähneln47. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass SARS-CoV-2-spezifische Gedächtnis-T-Zellen an der Infektionsstelle im Vergleich zum Blut angereichert sind48. Daher sind die geringen Häufigkeiten von Gedächtnis-T-Zellen, die wir im Blut beobachtet haben, wahrscheinlich eine Unterrepräsentation der residenten antigenspezifischen Gedächtnis-T-Zellen im Atemtrakt, die schnell auf die Antigen-Restimulation an den viralen Eintrittsstellen reagieren. Vermutlich kann eine bereits vorhandene residente T-Gedächtniszellpopulation an viralen Eintrittsstellen zu einer schnellen Virusclearance führen, bevor die Symptome offensichtlich auftreten. Darüber hinaus unterstützt die Feststellung, dass T-Zellen bei einer asymptomatischen Infektion höhere Mengen an IFNγ absondern als bei symptomatischen Patienten zu Beginn der Infektion44,47, dass Gedächtnis-T-Zellen in diesem Stadium eine Rolle spielen49. Obwohl die aktuelle Literatur bezüglich kreuzreaktiver CD8+ T-Zellen, die für SARS-CoV-2 spezifisch sind, gemischt ist, könnte dies durch die HLA-Spezifität erklärt werden50,51.

Insgesamt stützen unsere Ergebnisse nachdrücklich die Hypothese, dass HLA-B*15:01 eine asymptomatische COVID-19-Erkrankung durch bereits bestehende T-Zell-Immunität aufgrund einer früheren Exposition gegenüber HKU1-CoV und OC43-CoV vermittelt. Bemerkenswert ist, dass das NQK-Q8-Peptid unter den SARS-CoV-2-Varianten konserviert ist; Darüber hinaus weist unter allen HLA-B15:01-beschränkten SARS-CoV-2-abgeleiteten T-Zell-Epitopen, die in der Immune Epitope Database (ergänzende Abbildung 8) gemeldet werden, kein anderes Epitop eine hohe Sequenzidentität zwischen gängigen Coronaviren auf, mit Ausnahme des Replikase-Polyproteins 1ab-Peptid QLYLGGMSY. Dieses letzte Epitop wurde in der Literatur jedoch nicht als immundominant bei Patienten beschrieben, die positiv auf HLA-B*15:01 und SARS-CoV-2 sind. Auf der Grundlage der begrenzten verfügbaren Daten zu bekannten HLA-B*15:01-Epitopen bei SARS-CoV-2-Patienten bleibt NQK-Q8 das Hauptkandidatenpeptid, das jeder HLA-B*15:01-vermittelten T-Zell-Kreuzimmunität zugrunde liegt mit saisonalen Coronaviren.

Eine Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass alle Testergebnisse und Symptome in unserer Entdeckungskohorte selbst gemeldet wurden. Wir sind uns bewusst, dass dies zu einer gewissen Fehlerquote in unseren Ergebnissen führen kann. Wir haben diesen Ansatz jedoch zuvor validiert, indem wir die Testergebnisse bei einer Teilmenge der Teilnehmer überprüft haben52. Ebenso haben wir einige Symptome nicht abgefragt, insbesondere solche im Zusammenhang mit Hautausschlag und einfacher verstopfter Nase (im Gegensatz zu laufender Nase, die wir hier betrachten) und haben Personen, bei denen innerhalb unseres zweiwöchigen Zeitfensters nur ein einziges Symptom gemeldet wurde, nicht als symptomatisch betrachtet , was möglicherweise dazu geführt hat, dass einige Personen als asymptomatisch eingestuft wurden, obwohl sie tatsächlich leichte Symptome hatten. Wir haben jedoch eine zusätzliche „Gesundheitsprüfung“ in unsere Klassifizierung asymptomatischer Erkrankungen integriert, bei der wir die Antwort auf die Umfragefrage hinsichtlich ihrer Gründe für die Suche nach einem Test auf eine SARS-CoV-2-Infektion berücksichtigten. Obwohl unsere Selbstberichtsmethodik bedeutet, dass wir nicht definitiv sagen können, dass unsere asymptomatische Kohorte völlig frei von Symptomen war (und in einigen Fällen eher als leicht symptomatisch angesehen werden kann), sind wir zuversichtlich, dass unsere Einstufung von Personen als asymptomatisch war im Allgemeinen robust. Wichtig ist, dass wir in der gesamten Studie und in zwei unabhängigen Kohorten, in denen eine asymptomatische Erkrankung vom Arzt definiert wurde, eine sehr konsistente genetische Assoziation feststellen, was auf ein echtes biologisches Merkmal hinweist.

Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass unsere Assoziationsergebnisse auf Personen beschränkt sind, die sich selbst als weiß identifizieren. Obwohl unsere Studienkohorten in dieser Hinsicht nicht über ausreichende Daten verfügten, stellen wir fest, dass unsere Ergebnisse für HLA-B*15:01 bei schwarzen Personen einen ähnlichen Trend zu zeigen scheinen, obwohl dieses Ergebnis bei asiatischen und hispanischen Personen weniger klar ist (Ergänzungstabelle 11). . Aufgrund der geringen Anzahl an Individuen in Kombination mit der geringeren Häufigkeit dieses Allels in einigen Populationen ist es jedoch unmöglich, den Schluss zu ziehen, ob unsere Ergebnisse für die HLA-B*15:01-Assoziation mit asymptomatischer Erkrankung auf diese Vorfahren anwendbar sind. Eine letzte Einschränkung besteht darin, dass wir in unserer Ex-vivo-Analyse nur vier SARS-CoV-2-Peptide getestet haben. Die Suche nach weiteren Kandidatenpeptiden wird erleichtert, da weitere Studien die T-Zell-Reaktivität bei Patienten mit HLA-B*15:01 analysieren, ähnlich wie in einer früheren Studie28. Wir haben jedoch mindestens ein SARS-CoV-2-Peptid identifiziert, von dem zuvor bekannt war, dass es bei einer SARS-CoV-2-Infektion immundominant ist und das auf Gedächtnis-T-Zellen von HLA-B*15:01+-Personen reagierte, die vor der Pandemie gesammelt wurden.

Zusammenfassend haben wir einen starken und signifikanten Zusammenhang zwischen einem häufigen HLA-Klasse-I-Allel, HLA-B*15:01, und einer asymptomatischen Infektion mit SARS-CoV-2 nachgewiesen. Wir haben gezeigt, dass HLA-B*15:01+ T-Zellen aus Proben vor der Pandemie auf ein immundominantes SARS-CoV-2-Peptid reagierten, das eine hohe Sequenzähnlichkeit mit Peptiden saisonaler Coronaviren aufweist. Wir lieferten die molekulare Grundlage der T-Zell-Kreuzreaktivität, indem wir zeigten, dass HLA-B*15:01 Peptide von HKU1-CoV und OC43-CoV ähnlich wie das immundominante Peptid von SARS-CoV-2 stabilisieren und präsentieren kann. Darüber hinaus zeigen wir, dass öffentliche Klonotypen kreuzreaktiv und polyfunktional waren und beide NQK-Peptide mit hoher Affinität erkennen konnten. Unsere Ergebnisse haben wichtige Auswirkungen auf das Verständnis früher Infektionen und des Mechanismus, der einer frühen viralen Clearance zugrunde liegt, und könnten den Grundstein für eine Verfeinerung der Impfstoffentwicklung und therapeutischer Optionen bei frühen Erkrankungen legen.

Die Studienteilnehmer waren freiwillige Knochenmarkspender mit gültigen E-Mail-Adressen, die beim National Marrow Donor Program (NMDP) hinterlegt waren und die über eine E-Mail-Outreach-Kampagne, die im Juli 2020 begann, zur Teilnahme an der Studie eingeladen wurden Die NMDP-Datenbank ist ein bereits vorhandener Datensatz für die hochauflösende HLA-Genotypisierung, typischerweise für fünf Loci (HLA-A, -B, -C, -DRB1 und -DQB1)31. Teilnehmer, die sich für die Studie entscheiden, müssen ab Januar eine Smartphone-App herunterladen und an der COVID-19 Citizen Science-Studie teilnehmen (gestartet über die Eureka Digital Research Platform; https://eureka.app.link/covid19). 2021, nehmen Sie über die Website teil (https://covid19.eurekaplatform.org/). Nach der Einschreibung werden die Teilnehmer gebeten, eine erste 10- bis 15-minütige Umfrage zu den demografischen Ausgangsdaten, ihrer Gesundheitsgeschichte und ihren täglichen Gewohnheiten auszufüllen. Tägliche Folgefragen speziell zu Symptomen, wöchentliche Fragen zu Tests und monatliche Fragen zu Krankenhausaufenthalten wegen COVID-19 werden fortlaufend per Push-Benachrichtigung oder SMS übermittelt und erfordern 5 bis 15 Minuten pro Woche. Zum 30. April 2021 haben wir 29.947 Personen eingeschrieben, von denen 21.893 ihre Basiserhebung abgeschlossen haben (Ergänzungstabelle 12). Die Teilnahme an der UCSF Citizen Science-Studie und die Verknüpfung mit NMDP-HLA-Daten wurden vom Institutional Review Board der University of California, San Francisco (IRB 17-21879 bzw. IRB 20-30850) genehmigt. Alle Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab und stimmten der Forschung und Veröffentlichung der Forschungsergebnisse zu.

Innerhalb der mobilen Anwendung werden die Befragten während ihrer ersten Basisbefragung gefragt, ob sie jemals auf eine aktive Infektion getestet wurden, und geben das Ergebnis (positiv, negativ, weiß nicht) und die ungefähre Anzahl der Wochen seit dem Test an. Danach werden die Befragten jede Woche gefragt, ob sie in der Vorwoche getestet wurden, und das Ergebnis mitteilen. Wir betrachteten jeden, der einen positiven Test auf eine aktive Infektion meldete, als mit SARS-CoV-2 infiziert. Unsere Kohorte bestand aus Personen, die bis zum 30. April 2021 vor der Einführung einer umfassenden Impfung gegen das Virus einen positiven Test auf das Virus gemeldet hatten. Wir beschränkten die Analyse auf Personen, die sich selbst als „weiß“ identifiziert hatten, nur weil die Anzahl für die Analyse in den anderen Gruppen nicht ausreichte (Ergänzungstabellen 13 und 14), was eine Analyse von 1.428 Personen ermöglichte. Die Einschlusskriterien sind in der ergänzenden Abbildung 9 aufgeführt.

Die Symptome werden zu Beginn und in täglichen Umfragen selbst gemeldet. Im Rahmen der Basiserhebung werden die Befragten gebeten anzugeben, ob sie zu irgendeinem Zeitpunkt seit Februar 2020 drei Tage oder länger eines der in der Liste aufgeführten Symptome (Ergänzungstabelle 15) hatten. Dieselben Symptome werden in jeder täglichen Umfrage abgefragt, bei der sich die Befragten aufhalten fragten, ob bei ihnen jedes Symptom innerhalb der letzten 24 Stunden aufgetreten sei. Unter diesen Personen betrachteten wir diejenigen als asymptomatisch, die angaben, zu Studienbeginn einen positiven Test auf aktive Viren gehabt zu haben, bei denen seit dem Test mehr als zwei Wochen vergangen waren oder die keine Testtermine angegeben hatten, und die berichteten: „Keines der oben genannten.“ ” für alle Symptome in der Basiserhebung. Wir berücksichtigten auch die täglichen Symptomberichte für die zwei Wochen nach der Baseline für Befragte, die berichteten, dass bei der Baseline ein positiver Test auf eine aktive Infektion innerhalb der letzten zwei Wochen stattgefunden hatte. In diesen Fällen betrachteten wir Personen als asymptomatisch, wenn sie nicht nur zu Studienbeginn keine Symptome meldeten, sondern innerhalb dieses Zeitraums auch nicht zwei- oder mehrmals über ein einzelnes Symptom berichteten. Für Personen, die zu Studienbeginn keinen positiven Test auf eine aktive Infektion meldeten, später aber in einer wöchentlichen Umfrage einen positiven Test meldeten, verwendeten wir dieselben Kriterien unter Berücksichtigung der täglichen Symptomberichte für den Zeitraum 2 Wochen vor und 2 Wochen nach dem positiven Testbericht (Ergänzende Abbildung 10). Um das Fehlen von Symptomen weiter zu bestätigen, haben wir auch die Umfragefrage „Warum wurde der Test auf eine aktive COVID-19-Infektion (Virus) durchgeführt?“ berücksichtigt. (Ergänzungstabelle 16). Personen, die ansonsten keine Symptome meldeten, aber antworteten: „Ich hatte Symptome, die auf eine COVID-19-Infektion hindeuten“, wurden als symptomatisch eingestuft.

Die Studienteilnehmer waren in zwei UCSF-basierte prospektive Längsschnittkohorten eingeschrieben: die CHIRP-Studie und die LIINC-Studie. Die Teilnehmer wurden durch lokale klinische Systeme (UCSF Moffitt Hospital, San Francisco General Hospital, Kaiser, California Pacific Medical Center) sowie das San Francisco Department of Public Health identifiziert. Nach Bestätigung der SARS-CoV-2-Testergebnisse oder der SARS-CoV-2-Exposition zur Bestimmung der Eignung wurden die Teilnehmer gebeten, eine Einverständniserklärung zu unterzeichnen, einen Basisbesuch durchzuführen und persönliche Nachuntersuchungen zu vereinbaren. Die CHIRP-Studie umfasste Freiwillige mit positiver PCR-Testdokumentation und/oder Symptombeginn innerhalb der letzten 21 Tage. Eine asymptomatische Erkrankung wurde definiert als ein bestätigter positiver PCR-Test ohne jegliche Symptome („Hatten oder haben Sie immer noch Symptome, die Ihrer Meinung nach auf COVID-19 zurückzuführen sind?“) bei den Erst- und Nachuntersuchungen. Insgesamt wurden fünf Längsschnittproben von Teilnehmern mit akuter SARS-CoV-2-Infektion entnommen. Die erste Probe wurde <31 Tage nach Auftreten der Symptome oder <31 Tage nach der Exposition gegenüber SARS-CoV-2 als Basisbesuch in Woche 0 entnommen. Die übrigen Proben wurden in den Wochen 1, 3, 10 und 24 entnommen. Bei jedem CHIRP-Besuch wurden Blut und Nasopharynxabstriche entnommen. Die optionale Probenentnahme umfasste Sputum, Speichel, Stuhl und Urin. An der LIINC-Studie nahmen Teilnehmer mit einer früheren SARS-CoV-2-Infektion teil, die durch klinische Nukleinsäureamplifikationstests zwischen 14 und 90 Tagen nach Auftreten der ersten Symptome bestätigt wurde. Nach schriftlicher Einverständniserklärung wurden klinische Daten und Bioproben monatlich bis zu 4 Monate nach Beginn der Symptome und danach alle 4 Monate gesammelt. Bei jedem Besuch wurden Bioproben einschließlich Blut und Speichel entnommen. CHIRP und LIINC verwendeten einen harmonisierten Satz von Fallberichtsformularen, um klinische Daten über Demografie, Krankengeschichte, die COVID-19-Erkrankung und postakute Symptome zu sammeln. Zu den klinischen Messungen, die während persönlicher CHIRP-Besuche erhoben wurden, gehörten ein vollständiges Blutbild mit differenziellem, umfassendem Stoffwechselpanel, Erythrozytensedimentationsrate, hochempfindliches C-reaktives Protein, D-Dimer, Laktatdehydrogenase und Ferritin. Alle Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, in der sie der Forschung und Veröffentlichung der Forschungsergebnisse zustimmten, und die CHIRP- und LIINC-Studien wurden vom Institutional Review Board der University of California, San Francisco (IRB 20-30588 bzw. 20-30479) genehmigt. .

Insgesamt 100 ng hochwertige DNA wurden mit dem Library Prepare Enzymatic Fragmentation Kit 2.0 (Twist Bioscience) fragmentiert. Anschließend wurden die Enden der fragmentierten DNA repariert, Poly(A)-Schwänze hinzugefügt und durch PCR an Illumina-kompatible Dual-Index-Adapter ligiert, die eindeutig mit einem Barcode versehen waren. Nach der Ligation wurden die Fragmente mit AMPure XP-Magnetkügelchen im Verhältnis 0,8x (Beckman Coulter) gereinigt, gefolgt von einer Selektion in zwei Größen (Verhältnisse 0,42x und 0,15x), um Bibliotheken mit etwa 800 bp auszuwählen. Abschließend wurden die Bibliotheken mit Magnetkügelchen amplifiziert und gereinigt.

Nach der fluorometrischen Quantifizierung wurden 30 ng jeder Probe mithilfe von akustischer Ultraschallenergie präzise gepoolt und die gezielte Erfassung wurde mit dem Twist Target Enrichment Kit (Twist Bioscience) durchgeführt. Kurz gesagt, die Volumina wurden mithilfe von Magnetkügelchen reduziert und die DNA-Bibliotheken wurden an 1.394 biotinylierte Sonden gebunden, die für die HLA-Region spezifisch sind und alle Exons, Introns und regulatorischen Regionen von HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA- DRB1, HLA-DRA, HLA-DQB1, HLA-DQA1, HLA-DPB1 und HLA-DPA1. Fragmente, auf die die Sonden abzielten, wurden mithilfe von Streptavidin-Magnetkügelchen eingefangen und anschließend amplifiziert und gereinigt. Angereicherte Bibliotheken wurden mit dem BioAnalyzer (Agilent) analysiert und durch digitale Tröpfchen-PCR quantifiziert. Schließlich wurden angereicherte Bibliotheken mithilfe der NovaSeq-Plattform (Illumina) mit einem Paired-End-150-bp-Sequenzierungsprotokoll sequenziert. Nach der Sequenzierung wurden die Daten mit HLA Explorer v.1.4 (Omixon) und AlloSeq Tx V471 (CareDx) analysiert.

Wir haben die Primärdaten einer früheren Studie22 erneut analysiert, in der HLA-Gene der Klassen I und II bei 147 Personen europäischer Abstammung mit bekannter SARS-CoV-2-Infektion und einer Reihe von Symptomen sowie bei 69 asymptomatischen Krankenhausmitarbeitern analysiert wurden. In der Erstveröffentlichung wurde HLA-B*15:01 nicht direkt auf einen Zusammenhang mit einem asymptomatischen Krankheitsverlauf getestet. HLA-Genotypisierungsmethoden, Allelhäufigkeiten, Demografie und klinische Ergebnisse sind wie zuvor beschrieben.

In unserer Entdeckungskohorte untersuchten wir den Zusammenhang von fünf HLA-Loci (HLA-A, -B, -C, -DRB1 und -DQB1) mit asymptomatischer versus symptomatischer Infektion. Die Datenanalyse umfasste die ersten beiden Felder des Allelnamens, wie in der HLA-Nomenklatur beschrieben, die das vollständige Molekül bei der Auflösung der Polypeptidsequenz darstellten.

Erste Tests für HLA-Assoziationen wurden mit dem R-Paket BIGDAWG53 durchgeführt, das multiallelische HLA-Daten verarbeitet, um Assoziationen auf Haplotyp-, Locus-, Allel- und Aminosäureebene zu testen. Als nächstes verwendeten wir ein verallgemeinertes lineares Modell unter Verwendung von glm im R-Basispaket (v.4.3), um die relevanten Kovariaten, einschließlich aller gemeldeten Komorbiditäten, Geschlecht und Alter, für Allele zu berücksichtigen, bei denen nach Korrektur für mehrere zunächst festgestellt wurde, dass sie mit einer asymptomatischen Infektion assoziiert sind testen. Wir haben die P-Werte mithilfe der Bonferroni-Methode54 für die Anzahl der getesteten Allele bei HLA-A, -B und -DRB1 korrigiert, was das starke Bindungsungleichgewicht zwischen einigen der getesteten Loci erklärt. Für die Replikationskohorten haben wir nur das interessierende Allel getestet und dabei das beschriebene verallgemeinerte lineare Modellgerüst verwendet. Die Metaanalyse der Ergebnisse in unseren drei Kohorten wurde in R unter Verwendung des Common-Effect-Modells mit dem Metapaket (v.6.2-1)55 durchgeführt.

Die vier SARS-CoV-2-Peptide (Abb. 1a–c und Ergänzungstabelle 17) wurden durch In-vitro-Transkription und Translation von Oligonukleotiden, die jedes Peptid kodieren, unter Verwendung des PURExpress-In-vitro-Proteinsynthesekits (New England BioLabs) wie zuvor beschrieben synthetisiert56. Die Peptide NQK-Q8 (NQKLIANQF) und NKQ-A8 (NQKLIANAF) (verwendet in Abb. 1d und 2–4) wurden unter Verwendung der Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Methode der Festphasenpeptidsynthese synthetisiert. Der Prozess wurde mit dem automatisierten Peptidsynthesizer Biotage Initiator+ Alstra und Wang-Harz (100–200 Mesh, 1,24 mmol g−1) durchgeführt, das vor der Verwendung 2 Stunden lang in Dimethylformamid (DMF) gequollen wurde. Die in DMF gelösten Fmoc-Aminosäuren und HCTU/HOBt/DIPEA (4 Äquivalente) wurden dann nacheinander zum Harz gegeben und die Kopplungsreaktionen wurden unter Mikrowellenerwärmung bei 60 °C für 20 Minuten durchgeführt. Die Fmoc-Schutzgruppen wurden mit Piperidin (20 % in DMF) bei Raumtemperatur für 20 Minuten entfernt. Die Peptide wurden mit einer Mischung aus 95 % Trifluoressigsäure (TFA) und 5 % Triisopropylsilan (TIPS) 3 Stunden lang vom Harz abgespalten. Nach dem Eindampfen der TFA/TIPS-Mischung und der Fällung mit Diethylether wurden die Rohpeptide mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf dem Shimadzu HPLC-System gereinigt, das mit zwei Shimadzu LC-20AD-Pumpen, einem SIL-20AHT-Autosampler und SPD-M20A-Photodiodenarray-Detektor und ein FRC-10A-Fraktionssammler sowie eine semipräparative Säule vom Typ Onyx Monolithic C18, 100 × 10 mm mit einem Lösungsmittelsystem bestehend aus 0,1 % TFA in Wasser und Acetonitril über 30 Minuten. Die gereinigten Peptide wurden lyophilisiert und bei –20 °C gelagert. Die Reinheit wurde jeweils durch analytische HPLC mit >95 % bestätigt und die Strukturen wurden mittels hochauflösender Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bestätigt (ergänzende Abbildung 11).

Insgesamt wurden 20 nicht exponierte und 1 dreifach geimpfter (VAC62) Spender rekrutiert; Alle Einzelheiten sind in der Ergänzungstabelle 18 aufgeführt. PBMCs wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation von Vollblut oder Buffy Coats getrennt. PBMCs wurden frisch verwendet oder bis zur Verwendung kryogen gelagert. HLA-genotypisierte PBMCs aus den USA wurden im National Marrow Donor Program (NMDP)/Be The Match Research Sample Repository (ClinicalTrials.gov-Protokoll NCT04920474) gespeichert, das vor Beginn der COVID-19-Pandemie von gesunden Spendern gesammelt worden war. Alle Personen stimmten der Forschung und Veröffentlichung der Forschungsergebnisse zu und wurden zuvor für HLA-Klasse I und Klasse II genotypisiert. Die Ethikgenehmigung für die Durchführung der Forschung wurde vom QIMR Berghofer Medical Research Institute Human Research Ethics Committee (P2282) und dem La Trobe University Human Research Ethics Committee (HEC21097) eingeholt. Die HLA-Genotypisierung wurde von AlloSeq Tx17 (CareDx Pty) unter Verwendung der hochauflösenden AllType NGS-Getypisierung auf der IonTorrent NGS-Plattform durchgeführt.

Jedes Peptid wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers auf biotinyliertes HLA-B*15:01 (entweder maßgeschneidert oder von easYmers immunAware gekauft) geladen.

Für die kombinatorische Tetramerfärbung, die alle vier SARS-CoV-2-Peptide (Ergänzungstabelle 17) in Bezug auf Abb. 1a – c umfasste, wurden peptidbeladene HLA-B*15:01-Tetramer unter Verwendung von an PE, APC, PE konjugiertem Streptavidin erzeugt -CF594 oder BV421 gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurde jedem peptidbeladenen Tetramer d-Biotin (500 µM) zugesetzt und die Tetramere wurden kurz vor der Zellfärbung gepoolt. Kombinatorische Tetramerfärbung wurde verwendet, um jedes Epitop durch einzigartige Kombinationen von dualen Fluorophoren zu identifizieren, wobei mindestens einer der Fluorophore PE enthielt (Ergänzungstabelle 17). Die Häufigkeit antigenspezifischer T-Zellen wurde wie zuvor beschrieben berechnet57. Kurz gesagt, ein Aliquot von PBMCs wurde zur Färbung und Zählung der Zelloberfläche unter Verwendung von 123count eBeads (Invitrogen) verwendet. Die verbleibenden PBMCs wurden mit den angegebenen Tetramer-Pools angefärbt und unter Verwendung von magnetischen Anti-PE-Mikrokügelchen (Miltenyi) über einer Magnetsäule angereichert, die Zelloberfläche angefärbt und wie bei der Voranreicherung gezählt. CD8+-T-Zellen wurden durch Gating lebender Singulett-CD8+-Lymphozyten identifiziert, die negativ für CD4, CD14, CD16 und CD19 waren (ergänzende Abbildung 2 und ergänzende Tabelle 19). Es wurde eine stringente Tetramer-Gating-Strategie verwendet, bei der CD8+-T-Zellen, die nur mit zwei Fluorophoren markiert waren, als Antigen-spezifisch galten. Der Gedächtnisstatus von Tetramer-positiven CD8+ T-Zellen wurde durch das Fehlen der Koexpression von CCR7 und CD45RA bestimmt. Angesichts der geringen Anzahl der von Spendern verfügbaren Zellen wurden nur Tetramer+CD8+-T-Zellen mit einer Häufigkeit von mehr als 1 × 10−4 pro Gesamt-CD8+-T-Zellen als positiv angesehen.

Für die Tetramer-Färbung, die nur die NQK-Q8- und NQK-A8-Peptide umfasste (bezogen auf Abb. 1d und 2 und erweiterte Daten Abb. 1), wurden peptidbeladene HLA-B*15:01-Tetramer unter Verwendung von an Phycoerythrin konjugiertem Streptavidin erzeugt (SPORT). Mit Tetramer gefärbte Zellen wurden unter Verwendung von mit Anti-PE-Antikörpern beschichteten immunomagnetischen Perlen auf LS-Säulen (Miltenyi Biotech) gemäß den Anweisungen des Herstellers angereichert. Nach der Anreicherung wurden die Zellen mit einem Antikörper-Panel einschließlich Anti-CD3-BV480 (Verdünnung 1:100), Anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (1:50), Anti-CD4-BV650 (1:100) und Anti-Antikörper gefärbt -CD14-APCH7 (1:200), Anti-CD19-APCH7 (1:100), Anti-CD45RA-FITC (1:100), Anti-CD27-APC (1:100), Anti-CCR7-PE-Cy7 (1:50), Anti-CD95-BV421 (1:50), Anti-PD1-BV605 (1:100) (alle BD Biosciences) und Live/Dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain (1:1.000) (Life Technologien) (Ergänzende Abbildung 4). Die Zellen wurden in MACS-Puffer (PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) resuspendiert und mit dem BD Aria Fusion-System direkt nach Einzelzellindex in PCR-Platten (Eppendorf) sortiert.

CD8+ T-Zelllinien wurden wie zuvor beschrieben erzeugt25,58. Kurz gesagt, PBMCs wurden mit 1 μM einzelnem Peptid (NQK-Q8 oder NQK-A8) inkubiert und 10–14 Tage lang in RPMI-1640, ergänzt mit 2 mM MEM-Lösung nicht-essentieller Aminosäuren (Sigma-Aldrich), kultiviert, 100 mM HEPES (Sigma-Aldrich), 2 mM L-Glutamin (Sigma-Aldrich), Penicillin-Streptomycin (Life Technologies), 50 mM 2-ME (Sigma-Aldrich) und 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (Bovogen). Die Kulturen wurden zwei- bis dreimal wöchentlich mit 10 IE IL-2 ergänzt. Für die anschließende Analyse wurden CD8+-T-Zelllinien frisch verwendet. Für die Doppeltetramer-Färbungsexperimente wurden 0,5 × 106 Zellen aus den CD8+ T-Zelllinien mit einem einzelnen PE-konjugierten Tetramer (HLA-B*15:01-NQK-Q8 oder HLA-B*15:01-NQK-A8) gefärbt. oder mit beiden Tetrameren (PE-konjugiertes NQK-A8- und APC-konjugiertes NQK-Q8-Tetramer) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur doppelt gefärbt. Die Zellen wurden gewaschen und oberflächengefärbt mit Anti-CD3-BV480 (Verdünnung 1:100), Anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (1:50), Anti-CD4-BV650 (1:100), Anti-CD14- APCH7- (1:200) und Anti-CD19-APCH7-Antikörper (1:100) (alle BD Biosciences) und Live/Dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain (Life Technologies). Die Zellen wurden mit dem BD Aria Fusion-System nach Einzelzellen in PCR-Platten (Eppendorf) sortiert.

CD8+-T-Zelllinien wurden mit 1 μM des verwandten oder homologen Peptids stimuliert und 4–5 Stunden lang in Gegenwart von GolgiPlug, GolgiStop und Anti-CD107a-FITC (Verdünnung 1:100) (alle BD Biosciences) inkubiert. Nach der Stimulation wurden die Zellen 30 Minuten lang mit Anti-CD3-BV480- (1:100), Anti-CD8-PerCP-Cy5.5- (1:50) und Anti-CD4-BV650- (1:100) Antikörpern (alle) oberflächengefärbt BD Biosciences) und Live/Dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain (Life Technologies). Die Zellen wurden mit BD Cytofix/Cytoperm-Lösung (BD Biosciences) fixiert und permeabilisiert und dann intrazellulär mit Anti-IFN-γ-BV421 (1:100), Anti-TNF-PE-Cy7 (1:100), Anti-IL2- PE (1:100) und Anti-MIP-1β-APC (1:100) Antikörper (alle BD Biosciences) für weitere 30 Min. Die Zellen wurden auf dem BD FACSymphony A3-System mit der FACSDiva-Software (v.9.0.) erfasst. Die Analyse nach der Akquisition wurde mit der FlowJo-Software (Version 10) durchgeführt. Die in der Kontrollbedingung ohne Peptid identifizierten Zytokin-Nachweiswerte wurden in allen zusammenfassenden Diagrammen von den entsprechenden Testbedingungen abgezogen, um die unspezifische, spontane Zytokinproduktion zu berücksichtigen.

Die Einzelzell-Multiplex-PCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt59. Kurz gesagt, cDNA wurde mit dem VILO cDNA-Synthesekit (Invitrogen) bei 1/20 der Herstellerempfehlungen mit 0,1 % Triton X-100 erzeugt. Anschließend wurde eine verschachtelte PCR mit 40 α- und 27 β-Ketten durchgeführt. PCR-Produkte wurden mit ExoSAP (GE Healthcare) gereinigt und bei AGRF sequenziert. Die Sequenzen wurden mit FinchTV (Geospiza v.1.5.0) und der IMGT-Software60 analysiert. Die gezeigten CDR3-Sequenzen sind alle produktiv (keine Stoppcodons)61.

SPR-Experimente wurden bei 25 °C auf dem BIAcore T200-Gerät in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (Fisher Bioreagents), 150 mM NaCl (Merck), 0,005 % Tensid P20 (Cytiva) und 0,5 % BSA (Sigma-Aldrich) durchgeführt. . Streptavidin-Chips wurden verwendet, um biotinylierte HLA-B*15:01-NQK-Komplexe zu binden (gekoppelt an ~4.000 Reaktionseinheiten). Die erste Durchflusszelle wurde mit H2Db-PA (Negativkontrolle) beladen. Die Experimente wurden mit zehn Reihenverdünnungen der TCRs beginnend bei 100 oder 150 μM durchgeführt. Alle Experimente wurden zweimal doppelt durchgeführt (n = 2 unabhängige Experimente). BIAevaluation (Version 3.1) und GraphPad Prism 9 (Version 9.3) wurden für die in der Ergänzungstabelle 10 angegebene Datenanalyse verwendet.

TRA- und TRB-Sequenzen wurden mit der Software-Suite des International ImMunoGeneTics (IMGT) Information System62 analysiert. Die verwendete V(D)J-Gennomenklatur ist die der IMGT-Datenbank (www.imgt.org). Angereicherte Motive wurden mithilfe der Motiverkennungssoftware MEME Suite (v.5.5.2.)63 identifiziert. Die MEME-Software wählt die Breite und Häufigkeit jedes Motivs automatisch aus, um den E-Wert des Motivs zu minimieren. Motive wurden im Unterscheidungsmodus gesucht und als Sequenzlogos dargestellt, wobei die relativen Größen der Buchstaben ihre Häufigkeit im Sequenzsatz angeben und die Gesamthöhe der Buchstaben den Informationsgehalt der Position in Bits darstellt.

Zur Durchführung statistischer Analysen wurde GraphPad Prism 9 (v.9.3) verwendet. Statistische Vergleiche zwischen Gruppen wurden mithilfe einer ein- oder zweiseitigen Varianzanalyse mit Korrektur für Mehrfachvergleiche ermittelt. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Die schwere Kette von HLA-B*15:01, β2-Mikroglobulin und TCR-α- und β-Ketten wurden in BL21-Escherichia-coli-Zellen als Einschlusskörper exprimiert. HLA-B*15:01 wurde wie zuvor beschrieben neu gefaltet und gereinigt61. Kurz gesagt, lösliche HLA-B*15:01-NQK-Q8- oder -A8-Komplexe wurden durch Rückfaltung von Einschlusskörpern in den folgenden Mengen hergestellt: 30 mg schwere Kette, 10 mg β2-Mikroglobulin und 5 mg des Peptids in 200 ml Puffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0 (Fisher Bioreagents), 400 mM L-Arginin (Sigma-Aldrich), 500 µM Glutathion oxidiert (Goldbio), 5 mM Glutathion reduziert (Goldbio), 20 mM EDTA (Sigma-Aldrich). )). Das TRBV7-2-Gen hat vier Allele (TRBV7-2*01 und TRBV7-2*02/03/04), die Ser45 stromaufwärts der CDR2β-Schleife in Arg45 und Gly84 in Glu84 der HV4-Schleife64 ändern, was die pHLA-Erkennung beeinflussen könnte. Anhand der TCR-Sequenzierungsergebnisse konnten wir die Allele nicht unterscheiden. Da TRBV7-2*02/03/04 auf Proteinebene ähnlich sind, haben wir die TCRs entweder mit TRBV7-2*01 oder TRBV7-2*02 hergestellt. Die SPR-Ergebnisse zeigen, dass der Polymorphismus innerhalb der β-Kette keinen Einfluss auf die pHLA-Erkennung hatte (Extended Data Abb. 7 und 8 und Ergänzungstabelle 10). TCRs wurden durch Mischen von 100 mg der α-Kette und 50 mg der β-Kette in 400 ml desselben Puffers, der 5 M Harnstoff (Sigma-Aldrich) enthielt, neu gefaltet. Die Rückfaltungsmischungen wurden in 10 mM Tris-HCl pH 8,0 (Fisher Bioreagents) dialysiert. Die HLA-B*15:01-NQK-Komplexe und die TCRs wurden mittels Anionenaustauschchromatographie (DEAE und HiTrap Q, beide GE Heathcare) gereinigt.

Thermostabilitätstests wurden von DSF unter Verwendung des Echtzeit-PCR-Systems ViiA 7 (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, bei dem der HLA-B*15:01-YFP-Komplex mit einer Geschwindigkeit von 1 °C von 25 auf 95 °C erhitzt wurde min−1 in 0,5 °C-Schritten. Die Anregungs- und Emissionskanäle wurden auf den TAMRA-Reporter (x3m3-Filter) mit einer Anregung von ~550 nm und einer Detektion bei ~587 nm eingestellt. Das Experiment wurde in zweifacher Ausführung mit zwei pHLA-Konzentrationen (5 µM und 10 µM) durchgeführt. Jede Probe wurde in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (Fisher Bioreagents), 150 mM NaCl (Merck) dialysiert und enthielt eine Endkonzentration von 10 × SYPRO Orange Dye (Invitrogen). Die Fluoreszenzintensitätsdaten wurden normalisiert und mit GraphPad Prism 9 (v.9.3) aufgezeichnet. Der Tm-Wert für ein pHLA entspricht der Temperatur, bei der 50 % der maximalen Fluoreszenzintensität erreicht werden, was etwa 50 % des entfalteten Proteins entspricht und in der Ergänzungstabelle 9 zusammengefasst ist.

Kristalle von HLA-B*15:01-Peptidkomplexen wurden durch Dampfdiffusion mit hängendem Tropfen bei 20 °C gezüchtet. Das Protein:Reservoir-Tropfenverhältnis betrug 1:1 bei einer Konzentration von 3 mg ml−1 in 10 mM Tris-HCl, pH 8 (Fisher Bioreagents), 150 mM NaCl (Merck). Kristalle von HLA-B*15:01–NQK-Q8 wurden in 0,2 M Natriumformiat, pH 7,0 und 20 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol 3350 gezüchtet; und für HLA-B*15:01–NQK-A8 in 20 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol 3350 und 2 % (V/V) Ethylenglykol. Proteinkristalle wurden in einer Kryoschutzmittellösung eingeweicht, die Mutterlauge mit 20 % (v/v) Ethylenglykol enthielt, und dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Daten wurden an der MX2-Beamline am Australian Synchrotron, Teil von ANSTO, Australien65, gesammelt. Die Daten wurden mit XDS66 verarbeitet und die Strukturen wurden durch molekularen Ersatz mit dem PHASER-Programm (v.2.8.3)67 aus der CCP4-Suite68 mit einem Modell von HLA-B*15:01 ohne das Peptid (abgeleitet von Protein Data Bank) bestimmt (PDB) 5TXS)69. Die manuelle Modellerstellung wurde mit COOT70 durchgeführt, gefolgt von einer Verfeinerung mit BUSTER71 und PHENIX (v.1.20.1-4487)72. Die endgültigen Modelle wurden mithilfe des wwPDB OneDep-Systems validiert und hinterlegt. Die endgültigen Verfeinerungsstatistiken und PDB-Codes sind in der erweiterten Datentabelle 2 zusammengefasst. Alle molekularen grafischen Darstellungen wurden mit PyMOL (v.2.5) erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle HLA- und phänotypischen Daten für die Citizen Science- und CHIRP/LIINC- und UK-Kohorten sind in der öffentlichen Online-Datenbank verfügbar (http://www.hlacovid19.org/database/; Projekt 3 Hollenbach und Projekt 6 Langton). Die Kristallographiestrukturen sind im PDB unter den Zugangscodes 8ELG und 8ELH für HLA-B*15:01–NQK-A8 bzw. HLA-B*15:01–Q8 verfügbar.

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Wir danken den Tausenden Freiwilligen, die Knochenmark gespendet und sich die Zeit genommen haben, an dieser Studie teilzunehmen; die Mitarbeiter der Durchflusszytometrie-Einrichtungen der Universitäten La Trobe und Monash; N. Faramaz für seine Hilfe bei der TCR-Sequenzanalyse; und D. Jayasinghe für seine technische Unterstützung. Diese Studie wurde durch die Zuschüsse R01AI159260, 3U2CEB021881-05S1 und R21HG012386 der National Institutes of Health finanziert; der National Health and Medical Research Council (NHMRC); Medical Research Future Fund (MRFF2005654 an SG); NHMRC SRF (1159272 bis SG); und Research Training Program (RTP)-Stipendium (an LDM). Das CIBMTR wird hauptsächlich vom Public Health Service U24CA076518 des National Cancer Institute (NCI), des National Heart, Lung and Blood Institute (NHLBI) und des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) unterstützt; HHSH250201700006C von der Health Resources and Services Administration (HRSA); und N00014-20-1-2832 und N00014-21-1-2954 vom Office of Naval Research. Unterstützung wird auch von der Be the Match Foundation, dem Medical College of Wisconsin und dem National Marrow Donor Program geleistet. Die in diesem Artikel geäußerten Ansichten spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position des National Institute of Health, des Department of the Navy, des Department of Defense, der Health Resources and Services Administration (HRSA) oder einer anderen Behörde der US-Regierung wider.

Die folgenden Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Danillo G. August, Lawton D. Murdolo, Demetra SM Chatzileontiadou

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Stephanie Gras, Jill A. Hollenbach

Weill Institute for Neurosciences, Abteilung für Neurologie, University of California, San Francisco, CA, USA

Danilo G. Augusto, Joseph J. Sabatino Jr., Tasneem Yusufali, Kerry Kizer, Karoline Guthrie und Jill A. Hollenbach

Department of Biological Sciences, The University of North Carolina at Charlotte, Charlotte, NC, USA

Danillo G. Augusto

Postgraduiertenprogramm in Genetik, Bundesuniversität Paraná, Curitiba, Brasilien

Danillo G. Augusto

Abteilung für Biochemie und Chemie, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, Bundoora, Victoria, Australien

Lawton D. Murdolo, Demetra SM Chatzileontiadou, Michael J. Dewar-Oldis, Peter J. Barnard und Stephanie Gras

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Biomedicine Discovery Institute, Monash University, Clayton, Victoria, Australien

Demetra SM Chatzileontiadou & Stephanie Gras

Abteilung für Kardiologie, Abteilung für Medizin, University of California, San Francisco, CA, USA

Noah D. Peyser, Xochitl Butcher, Gregory M. Marcus und Jeffrey E. Olgin

Abteilung für HIV, Infektionskrankheiten und globale Medizin, Department of Medicine, University of California, San Francisco, CA, USA

Victoria W. Murray, Vivian Pae, Sannidhi Sarvadhavabhatla, Fiona Beltran, Gurjot S. Gill, Michael J. Peluso, Rebecca Hoh, Steven G. Deeks und Sulggi Lee

Abteilung für Labormedizin, University of California, San Francisco, CA, USA

Kara L. Lynch & Cassandra Yun

Institut für klinische und translationale Wissenschaft, University of Utah, Salt Lake City, UT, USA

Colin T. Maguire

Abteilung für experimentelle Medizin, Department of Medicine, University of California, San Francisco, CA, USA

Timothy J. Henrich

Medizinische Fakultät, University of California, San Francisco, CA, USA

Michelle Davidson

Abteilung für Epidemiologie und Biostatistik, University of California, San Francisco, CA, USA

Scott Lu, Sarah A. Goldberg, J. Daniel Kelly, Jeffrey N. Martin, Mark J. Pletcher und Jill A. Hollenbach

FI Proctor Foundation, University of California, San Francisco, CA, USA

J. Daniel Kelly

CIBMTR (Center for International Blood and Marrow Transplant Research), National Marrow Donor Program/Be The Match, Minneapolis, MN, USA

Cynthia A. Vierra-Green, Stephen R. Spellman und Martin Maiers

ExplantLab, Newcastle-upon-Tyne, Großbritannien

David J. Langton

QIMR Berghofer Centre for Immunotherapy and Vaccine Development Brisbane, QIMR Berghofer Medical Research Institute, Brisbane, Queensland, Australien

Corey Smith

Abteilung für Allgemeine Innere Medizin, University of California, San Francisco, CA, USA

Mark J. Pletcher

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JAH, DGA, SG, DSMC, LDM und MM haben diese Arbeit konzipiert. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC, LDM, GMM, JEO, MJ Pletcher., NDP und MM haben die Methodik entwickelt. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC, LDM und KG führten die formale Analyse durch. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC und LDM führten die Untersuchungen durch. JAH, PJB, CS, SG, CAV-G., SRS, DJL, S. Lee., MM, GMM, JEO und MJ Pletcher. erhaltene Ressourcen. JAH, DGA, SG, DSMC, LDM, TY, NDP, XB, KK, VWM, VP, SS, FB, GSG, KLL, CY, CTM, MJ Peluso., RH, TJH, SGD, MD, S. Lu. , SAG, JDK, JNM, CAV-G., SRS, DJL, MJD-O., CS, S. Lee., GMM, JEO und MJ Pletcher. übernahm die Probensammlung und Datenkuratierung. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC, LDM und MJD-O. waren für die Visualisierung verantwortlich. JAH, SG, DSMC und S. Lee. Fördermittel erhalten haben. JAH und SG übernahmen die Projektverwaltung. Für die Aufsicht waren JAH, SG, DSMC und PJB verantwortlich. JAH, DGA, JJS, SG, DSMC und LDM haben den Originalentwurf geschrieben. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Jill A. Hollenbach.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Donald Vinh, Lawrence Stern und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a–b) Individuelle FACS-Diagramme für jede Spenderprobe vor der Pandemie, die für die Ex-vivo-Tetramer-Färbung nach magnetischer Tetramer-Anreicherung mit tet-A8-Tetramer (a) und mit tet-Q8-Tetramer (b) von 5 bzw. 7 Spendern verwendet wurde . Die beobachteten angereicherten Tetramer+ CD8+ T-Zellen sind im inneren Quadrat angegeben.

(a,b) FACS-Diagramme von NQK-A8-Tetramer+ CD8+ T-Zellen nach magnetischer Tetramer-Anreicherung (a) und NQK-Q8-Tetramer+ CD8+ T-Zellen (b). Die NQK-A8- und NQK-Q8-Tetramer+ CD8+ T-Zellen, dargestellt als blaue Punkte, wurden im Vergleich zu den CD3+ T-Zellen, dargestellt als graue Punkte, aufgetragen und auf CCR7 und CD45RA gegatet, um den Gedächtnisstatus zu bestimmen, nach der magnetischen Anreicherung des Tetramers für jeden Spender. (c) Der Prozentsatz an Tetramer+ von CD8+ T-Zellen nach magnetischer Tetramer-Anreicherung wird für jeden Spender mit dem violetten Balken für das Tet-Q8-Tetramer und dem orangefarbenen Balken für das Tet-A8-Tetramer angegeben (n = 7 und n = 6, biologisch unabhängig). Proben). Die Daten werden als Medianwerte mit IQR (Interquartilbereich) dargestellt. Der individuelle Prozentsatz für jeden Spender ist auf den Feldern a und b angegeben. (d) Der Anteil von Tnaive (CD45RA+CCR7+CD95-); TSCM (Stammzellgedächtnis, CD45RA+CCR7+CD95+); TCM (zentraler Speicher, CD45RA-CCR7+); TEM (Effektorspeicher, CD45RA-CCR7-); TEMRA-Zellen (terminal differenziert, CD45RA+CCR7-) bei verschiedenen Spendern.

Die Häufigkeit von CD8+ T-Zellen mit unterschiedlichen Effektorfunktionen (IFNγ, TNF, IL-2, MIP-1β, CD107a) wurde zusammen mit der Anzahl unterschiedlicher Funktionen abzüglich der Kontrolle ohne Peptid bestimmt. Der äußere Ring des Doppelringkuchens zeigt das Funktionsprofil in verschiedenen Farben gemäß der Tabelle und der innere Ring stellt die Anzahl der Funktionen dar, wobei Schwarz für 5 und Weiß für 1 steht.

Heatmaps, die die bevorzugte TRAV- (links) und TRBV-Nutzung (rechts) von NQK-Q8-, NQK-A8- oder beiden (doppelten) peptidspezifischen TCRs bei allen nicht exponierten Spendern insgesamt anzeigen.

Zusammenfassung der Längen von CDR3α (links) und CDR3β (rechts) und Motivanalyse für die NQK-A8 (oben), NQK-Q8 (Mitte) und beide Peptide (unten)-spezifischen TCR-Klontypen bei nicht exponierten Spendern. Das MEME-Motiverkennungsprogramm wurde verwendet, um angereicherte Motive zu identifizieren. Die relative Größe jedes Restsymbols ist proportional zu seiner Häufigkeit, während die Gesamthöhe der aa-Symbole den Informationsgehalt der Position in Bits angibt. Das Motiv im oberen linken Feld ist das 13 Aminosäuren (aa) lange CDR3α-Sequenzmotiv, das von allen erhaltenen CDR3α-Sequenzen abgeleitet ist (n = 165); Auf der rechten oberen Seite ist das CDR3β-16-aa-lange Sequenzmotiv abgebildet, das von allen erhaltenen CDR3β-Sequenzen abgeleitet ist (n = 220).

(a–b) Strukturen von HLA-B*15:01-NQK-Q8 (Peptid als violetter Kranz) (a) und HLA-B*15:01-NQK-A8 (Peptid als orangefarbener Stab) (b), mit die HLA-Kette im weißen Cartoon. (c–d) Elektronendichtekarte um die Peptide NQK-Q8 (violetter Stab) bzw. NQK-A8 (orangefarbener Stab), in Grün bei 3 s für die Fo-Fc-Karte. (e–f) Elektronendichtekarte um die Peptide NQK-Q8 (lila Stab) bzw. NQK-A8 (orangefarbener Stab), in Blau bei 1 s für die 2Fo-Fc-Karte. (g–h) B-Faktor-Analyse der Atome der NQK-Q8- bzw. NQK-A8-Peptide. Die Atome sind entsprechend ihrem B-Faktor gefärbt, der die Mobilität jedes Atoms von niedrig (blau) bis hoch (rot) angibt.

SPR-Sensogramme für die 5 getesteten TCRs, wobei jede Kurve eine unterschiedliche Konzentration des TCR zeigt.

Steady-State-Bindungskurve für die fünf getesteten TCRs gegenüber dem HLA*15:01-NKQ-Q8- oder -A8-Komplex. Analyten (TCRs) flossen über immobilisiertes HLA*15:01-NKQ-Q8 oder -A8 mit einem Konzentrationsbereich von 0 bis 100 μM. n = 2 biologisch unabhängige Experimente, die doppelt durchgeführt wurden, wobei die Grafik die Ergebnisse eines Experiments zeigt.

Diese Datei enthält ergänzende Abbildungen. 1–11.

Diese Datei enthält die Ergänzungstabellen 1–19.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Augusto, DG, Murdolo, LD, Chatzileontiadou, DSM et al. Ein häufiges HLA-Allel ist mit einer asymptomatischen SARS-CoV-2-Infektion verbunden. Natur 620, 128–136 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06331-x

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Eingegangen: 10. Oktober 2022

Angenommen: 15. Juni 2023

Veröffentlicht: 19. Juli 2023

Ausgabedatum: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06331-x

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